Découverte de nouveaux marqueurs pharmacogénomiques de la maladie du greffon contre l'hôte en transplantation de cellules souches hématopoïétiques

La transplantation de cellules souches hématopoïétiques (CSH) constitue une avenue thérapeutique potentiellement curative pour plusieurs cancers hématologiques comme la leucémie. L’utilisation d’une thérapie immunosuppressive pour prévenir la maladie du greffon contre l’hôte (GvHD) est un déterminant majeur du succès de la greffe. Malgré tout, cette complication survient chez 25 à 50% des transplantés et est une cause majeure de mortalité. L’optimisation du régime d’immunosuppression est un facteur facilement modifiable qui pourrait améliorer le pronostic des patients. Particulièrement, les polymorphismes du génome du donneur ou du receveur dans les voies pharmacogénomiques des immunosuppresseurs pourraient influencer l’exposition et l’action de ces médicaments, de même que le pronostic du patient. Le profilage de 20 pharmacogènes prioritaires chez des paires de donneurs-receveurs en greffe de CSH a permis d’identifier des variations génétiques liées au risque de la GvHD aiguë. Principalement, le statut génétique du receveur pour les protéines ABCC1 et ABCC2, impliquées dans le transport du méthotrexate (MTX), ainsi que des cibles moléculaires de ce médicament (ATIC et MTHFR) ont été associées au risque de GvHD aiguë. Similairement, le NFATc1, codant pour une cible moléculaire de la cyclosporine, augmentait lui aussi le risque de la maladie. Les porteurs de deux génotypes à risque et plus étaient particulièrement prédisposés à développer cette complication. Par surcroît, le statut génétique du donneur influençait également le pronostic du receveur après la greffe. Entre autres, des allèles protecteurs ont été identifiés dans les voies liées au transport (SLC19A1) et à l’action du MTX (DHFR). Inversement, NFATc2 a été associé à une augmentation du risque de GvHD aiguë. Afin de mieux comprendre les associations observées entre ces marqueurs génétiques et le risque de GvHD aiguë, une étude prospective innovante est en cours chez des greffés de CSH. Cette étude permettra d’étudier comment la génétique du patient ou du donneur peut influencer la pharmacocinétique et la pharmacodynamie des immunosuppresseurs, de même que leurs liens avec la GvHD aiguë. Ces paramètres sont quantifiés grâce à des approches analytiques que nous avons mises au point afin de répondre aux besoins spécifiques et uniques de cette étude. Les approches proposées dans cette thèse sont complémentaires aux méthodes classiques de suivi des immunosuppresseurs et pourraient aider à optimiser la pharmacothérapie du patient. Une meilleure identification des patients à haut risque de GvHD aiguë avant la greffe, basée sur des marqueurs pharmacogénomiques identitaires, pourrait guider le choix de la prophylaxie immunosuppressive, et ainsi améliorer l’issue clinique de la greffe.

Expansion ex vivo des cellules CD34+ du sang adulte: étude du microenvironnement et caractérisation des cellules générées en condition d’hypoxie

Les transplanteurs ont actuellement trois options lorsqu’ils doivent choisir une source de cellules pour la greffe de cellules souches hématopoïétiques soit le sang de cordon, la moelle osseuse ou le sang périphérique mobilisé. Les cellules souches hématopoïétiques retrouvées dans le sang des adultes sains pourraient toutefois être une autre option intéressante pour la transplantation. Les résultats de cette présente étude, récemment publié dans la revue Cytotherapy, montrent le potentiel des cellules CD34+ trappées dans les chambres de leucoréduction à générer les différentes lignées cellulaires retrouvées dans le sang. Un système de culture in vitro en milieu sans sérum et en condition hypoxique a été mis a point. La différenciation des cellules dans l’hématopoïèse durant la culture a été caractérisée par analyse multiparamétrique du phénotype avec SPADE. L’expansion a généré une grande hétérogénéité populationnelle mais principalement des progéniteurs engagés vers l’érythropoïèse et la mégacaryopoïèse.

Rôle des cellules myéloïdes dans des modèles murins de la neuroinflammation

L’inflammation du système nerveux central (SNC), appelée neuroinflammation, est un aspect inséparable des maladies neurodégénératives chroniques comme la sclérose en plaques (SEP) et la maladie d’Alzheimer (MA). La caractérisation de la signature moléculaire spécifique à chaque population cellulaire dans des pathologies distinctes va aboutir à la compréhension et donc au contrôle de la neuroinflammation. Le présent ouvrage a pour but de mieux comprendre les mécanismes d’action de deux types cellulaires myéloïdes, la microglie et les neutrophiles, au cours des affections neuroinflammatoires du SNC. Ainsi, le premier objectif a été de comprendre le rôle des cytokines IL-36 dans la neuroinflammation établie au cours de l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE). Dans une seconde partie, l’objectif a été d’explorer l’action du GPR84, un récepteur couplé à la protéine G spécifique à la microglie dans le SNC, lors de l’altération des fonctions cérébrales dans un modèle de souris transgénique de la MA. Nos résultats démontrent que la voie de signalisation IL-36/IL36R est augmentée dans trois modèles différents de l’EAE, mais ne contribue pas au développement ni à la progression de la pathologie. En utilisant l’approche de cytométrie en flux nous identifions les neutrophiles comme la source majeure de l’IL-36γ. De plus, nous démontrons que la microglie exprime l’IL-36R et sa stimulation par l’IL-36γ conduit à la production de cytokines pro-inflammatoires. Dans un second temps, nous caractérisons l’augmentation de l’expression du GPR84 par la microglie dans le modèle murin de la MA APP/PS1. Ainsi, le croisement de ces souris avec des souris déficientes en GPR84 diminue l’activation et le recrutement de la microglie autour des plaques d’amyloïde-β et accélère le déclin cognitif. Nos études impliquent le GPR84 comme un acteur important dans le maintien de l’homéostasie neuronale puisque son absence favorise la dégénérescence des dendrites dans le cerveau. Les résultats obtenus dans cette thèse apportent de nouveaux éléments qui peuvent contribuer au développement des thérapies qui ciblent les cellules myéloïdes dans diverses pathologies du SNC. Ces données ouvrent de nouvelles pistes pour élucider le rôle de l’IL-36γ dans des maladies neurodégénératives. Enfin, pour une première fois, nous présentons un modèle murin permettant d’identifier le(s) ligand(s) endogène(s) du GPR84, une cible thérapeutique potentielle pour la prévention et/ou le traitement de la MA.

Rôle du gène de fusion MLL-ENL dans le développement et le maintien du phénotype leucémique

Les translocations chromosomiques du gène MLL sont connues pour mener au développement de leucémies aiguës. La translocation avec un de ses partenaires de fusion les plus communs, ENL, peut engendrer des leucémies aiguës de plusieurs types différents pour cette même translocation. Une fois la leucémogenèse initiée par la fusion MLL-ENL, son rôle quant au maintien du phénotype leucémique n’est pas encore bien connu à ce jour. Pour mieux comprendre l’importance de MLL-ENL après la leucémogenèse, des cellules souches/progénitrices de sang de cordon ombilical humain purifiées ont ainsi été transduites par un virus exprimant le gène de fusion MLL-ENL bordé par des sites LoxP ainsi que le marqueur eGFP. Ces cellules infectées ont ensuite été injectées dans notre modèle de souris immunodéficientes irradiées et placées sous observation pendant 24 semaines pour voir le développement de leucémies aiguës. Elles ont alors été sacrifiées et les cellules la moelle osseuse et de la rate ont ensuite été analysées par cytométrie en flux pour déterminer si la xénogreffe a engendré une leucémie dans notre modèle ainsi que le phénotype de celle-ci. Les souris injectées par les cellules infectées par le MLL-ENL ont généré uniquement des leucémies lymphoïdes aiguës de type B. Les cellules de ces leucémies primaires isolées ont été par la suite infectées par un lentivirus exprimant la cre-recombinase et le marqueur BFP afin d’exciser le gène MLL-ENL des cellules leucémiques grâce aux sites LoxP. Les cellules ont ensuite été triées pour le marqueur BFP et injectées dans des souris secondaires pour de voir si les cellules leucémiques souches pouvaient toujours régénérer la leucémie. Les conséquences de l’absence de MLL-ENL dans le maintien du phénotype leucémique n’ont cependant pas pu être vérifiées à cause d’une erreur dans la séquence de la cre-recombinase, mais nous avons observé la régénération des leucémies secondaires.

Étude des gènes de fusion MLL dans les leucémies aigues humaines

Les leucémies aigues sont la conséquence d’une prolifération clonale et maligne des cellules hématopoïétiques. Elles surviennent suite à un évènement oncogénique qui se produit dans une cellule souche hématopoïétique (CSH) ou progénitrice. Cela lui confère une certaine instabilité qui engendre l’accumulation d’autres évènements génétiques et/ou épigénétiques responsables du développement clinique de la maladie. Les leucémies MLL représentent environ 10% des leucémies aigues et aujourd’hui, plus de 70 gènes de fusion ont été caractérisés. Les sangs de cordon sont une source importante de CSH et progénitrices. La purification de ces cellules et leur transformation en cellules leucémiques à l’aide de gènes de fusion MLL nous permettent de générer des leucémies aigues humaines dans des souris immunodéficientes NSG et ainsi étudier le potentiel leucémique de différents gènes de fusion MLL. Dans un premier temps, 4 gènes de fusion MLL ont été étudiés : MLL-AF9, MLL-AF4, MLL-ENL et MLL-ELL. In vitro, nous sommes capables de transformer des CSH en cellules leucémiques capables de proliférer rapidement. Les résultats in vivo nous montrent qu’il est possible de générer des leucémies avec les oncogènes MLL-AF9 et MLL-ENL. Pour les fusions MLL-ELL et MLL-AF4, bien que quelques leucémies ont pu être obtenues, plusieurs problèmes techniques nous empêchent aujourd’hui de disposer d’un modèle adéquat permettant l’étude complète de ces oncogènes. Dans un second temps, les leucémies aigues MLL-AF9 ont été étudiées dans un modèle contrôlé où les cellules souches proviennent d’un donneur unique. Grâce à ce modèle, nous avons pu démontrer que l’oncogène MLL-AF9 est suffisant pour induire le développement de la maladie. En effet aucune nouvelle mutation n’a pu être identifiée au cours du développement de la leucémie. Parmi les leucémies myéloïdes aigues (LMA) MLL-AF9 issues de ce modèle, certains gènes non mutés, dont RET, ont été identifiés comme étant de potentiels biomarqueurs de ce sous-groupe de leucémie.

Effets du stress oxydatif induit par les rayons UVA et endogène sur la cornée humaine : étude des délétions de l’ADN mitochondrial, des modifications dans la matrice extracellulaire cornéenne et de la dystrophie cornéenne endothéliale de Fuchs

Le stress oxydatif peut provenir de sources exogènes comme les UVA ou de sources endogènes comme la chaîne respiratoire (OXPHOS). L’oxydation des composants cellulaires a été associée avec la dégénération, des phénotypes de vieillissement et des pertes de fonctionnalités des tissus. Les UVA sont les plus efficaces des rayons UV à induire de l’oxydation, tel que démontré par la formation de dommages oxydatifs à l’ADN et par l’apparition de délétions mitochondriales qui en résultent. La délétion mitochondriale de 4977 pb (ADNmtCD4977), la plus commune, et celle de 3895 pb (ADNmt3895) sont deux délétions reliées au photovieillissement cutané et à l’exposition au stress oxydant. Le phénomène de vieillissement dans la peau est bien documenté et se traduit par une dégradation de la matrice extracellulaire, une perte d’élasticité et la formation de rides. Toutefois, peu d’études portent sur la cornée humaine alors qu’elle est un tissu exposé directement aux rayonnements UV au même titre que la peau. Nous avons donc tenté mieux comprendre l’effet de l’oxydation exogène et endogène sur cette structure. L’analyse de la localisation des délétions ADNmtCD4977 et ADNmtCD4977 dans l’oeil humain a permis de révéler qu’elles se concentrent principalement dans le stroma cornéen et s’accumule avec l’âge. Le stroma cornéen est la couche cellulaire qui confère la transparence et la rigidité à la cornée humaine. Ces résultats nous ont suggéré une implication des UVA dans le photovieillissement de la cornée. Nous avons donc entrepris de vérifier les changements liés à l’exposition aux UVA dans le stroma cornéen puisque les UVA sont connus pour causer des altérations à la matrice extracellulaire (ECM) au niveau cutané. Nous avons donc créé un modèle de photovieillisement par une exposition chronique aux UVA sur des kératocytes avec lesquels nous avons fait sécréter une ECM. Nos résultats nous ont démontré qu’une exposition chronique aux UVA cause des altérations à l’ECM cornéen semblable à des phénotypes de photvieillissement. En effet, nous avons dénoté des changements transcriptomiques et protéomiques pour certains collagènes et protéoglycans. Une atteinte aux collagènes par le vieillissement cornéen se traduit entre autres par une rigidification, une opacification et un changement dans son pouvoir réfractif qui mène à une perte de la vision. Par ailleurs, notre avons également investigué l’implication du stress oxydatif dans la dystrophie cornéenne endothéliale de Fuchs (FECD), une maladie dégénérative de l’endothélium cornéen, qui mène à une perte de vision et est une cause principale de greffe cornéenne. L’étiologie de la maladie est encore inconnue, mais le stress oxydatif est soupçonné de jouer un rôle important dans la pathogenèse. Nos résultats ont amené de nouvelles évidences de l’implication de l’oxydation dans la maladie par l’augmentation de la quantité d’ADN mitochondrial et un raccourcissement des télomères dans des explants de cornées pathologiques. Nos résultats nous ont également démontré que la mise en culture de cellules FECD permettait la sélection de cellules fonctionnelles et comparables à des cellules saines en termes de quantité d’ADN mitochondrial et de son intégrité, de sensibilité à l’oxydation et de longueur télomérique. Les résultats obtenus soutiennent ainsi la possibilité d’employer les cellules FECD fonctionnelles sélectionnées pour utilisation en génie tissulaire afin de créer des cornées autologues pour pallier aux manques de greffes cornéennes. Enfin, nos résultats apportent de nouvelles évidences quant à l’implication du stress oxydatif dans le photovieillissement cornéen et dans l’étiologie de la FECD.

Évaluation de l’impact de pansements biologiques humains produits par génie tissulaire sur la guérison de plaies cutanées murines

L’étude de la guérison des plaies à l’aide de substituts produits par génie tissulaire est un domaine en plein essor. Dans ces travaux, les effets de pansements biologiques produits en laboratoire à partir de cellules souches/stromales du tissu adipeux (CSTA) différenciées ou non en adipocytes ont été évalués sur des plaies cutanées in vivo. Un modèle de souris possédant un épiderme fluorescent a permis de démontrer que les plaies traitées avec les pansements biologiques guérissent plus rapidement que les plaies non traitées, et ce, de manière indépendante de la réépithélialisation. Une augmentation de la formation du tissu de granulation et une angiogenèse accrue ont également été observées dans les groupes traités. Ces résultats établissent que les substituts contenant des CSTA ou des adipocytes fonctionnels favorisent la réparation tissulaire. À terme, ces travaux pourraient mener au développement de nouvelles indications cliniques pour le traitement des ulcères cutanés.

Développement d'une méthode de prédiction de l'orientation et de l'insertion des protéines dans une membrane modèle

Les protéines membranaires intégrales jouent un rôle indispensable dans la survie des cellules et 20 à 30% des cadres de lectures ouverts codent pour cette classe de protéines. La majorité des protéines membranaires se trouvant sur la Protein Data Bank n’ont pas une orientation et une insertion connue. L’orientation, l’insertion et la conformation que les protéines membranaires ont lorsqu’elles interagissent avec une bicouche lipidique sont importantes pour la compréhension de leur fonction, mais ce sont des caractéristiques difficiles à obtenir par des méthodes expérimentales. Des méthodes computationnelles peuvent réduire le temps et le coût de l’identification des caractéristiques des protéines membranaires. Dans le cadre de ce projet de maîtrise, nous proposons une nouvelle méthode computationnelle qui prédit l’orientation et l’insertion d’une protéine dans une membrane. La méthode est basée sur les potentiels de force moyenne de l’insertion membranaire des chaînes latérales des acides aminés dans une membrane modèle composèe de dioléoylphosphatidylcholine.

Impacts des dépositions atmosphériques de fer sur les assemblages phytoplanctoniques et la production de diméthylsulfure dans le Pacifique Nord-Est contemporain et dans le contexte de l’acidification des océans

La croissance du phytoplancton est limitée par les faibles concentrations de fer (Fe) dans près de 40% de l’océan mondial. Le Pacifique subarctique Nord-Est représente une de ces zones limitées en fer et désignées High Nutrient - Low Chlorophyll (HNLC). Cet écosystème, dominé par des cellules de petite taille telles les prymnésiophytes, est caractérisé par de très faibles concentrations estivales de chlorophylle a et de fortes concentrations de macronutriments. Il a été maintes fois démontré que les ajouts de fer, sous différentes formes chimiques (habituellement FeSO4), dans les zones HNLC, stimulent la croissance et modifient la structure des communautés planctoniques en favorisant la croissance des cellules de grande taille, notamment les diatomées. Ces effets sur la communauté planctonique ont le potentiel d’influencer les grands mécanismes régulateurs du climat, tels la pompe biologique de carbone et la production de diméthylsulfure (DMS). Les poussières provenant des déserts du nord de la Chine sont reconnues depuis longtemps comme une source sporadique importante de fer pour le Pacifique Nord-Est. Malgré leur importance potentielle, l’influence directe exercée par ces poussières sur l’écosystème planctonique de cette zone HNLC n’a jamais été étudiée. Il s’agit d’une lacune importante puisque le fer associé aux poussières est peu soluble dans l’eau de mer, que la proportion biodisponible n’est pas connue et que les poussières peuvent avoir un effet inhibiteur chez le phytoplancton. Cette thèse propose donc, dans un premier temps, de mesurer pour la première fois l’effet de la fertilisation de la communauté planctonique du Pacifique Nord-Est par un gradient de concentrations de poussières désertiques naturelles. Cette première expérimentation a démontré que le fer contenu dans les poussières asiatiques est biodisponible et qu’une déposition équivalente à celles prenant place au printemps dans le Pacifique Nord-Est peut résulter en une stimulation significative de la prise de nutriments et de la croissance du phytoplancton. Mes travaux ont également montré que l’ajout de 0,5 mg L-1 de poussières peut résulter en la production d’autant de biomasse algale que l’ajout de FeSO4, l’espèce chimique utilisée lors des expériences d’enrichissement en fer à grande échelle. Cependant, les ajouts de FeSO4 favorisent davantage les cellules de petite taille que les ajouts de poussières, observation démontrant que le FeSO4 n’est pas un proxy parfait des poussières asiatiques. Dans un deuxième temps, je me suis intéressée à une source alternative de fer atmosphérique, les cendres volcaniques. Mon intérêt pour cette source de fer a été attisé par les observations d’une floraison spectaculaire dans le Pacifique Nord-Est, ma région d’étude, associée à l’éruption de 2008 du volcan Kasatochi dans les îles Aléoutiennes. Forte de mon expérience sur les poussières, j’ai quantifié l’effet direct de ces cendres volcaniques sur la communauté planctonique du Pacifique Nord-Est. Mes résultats ont montré que le fer contenu dans les cendres volcaniques est également biodisponible pour le phytoplancton. Ils ont également montré que cette source de fer peut être aussi importante que les poussières désertiques dans la régulation de la croissance du phytoplancton dans cette partie de l’océan global à l’échelle millénaire. Dans un troisième temps, j’ai estimé comment l’acidification des océans modulera les réponses des communautés planctoniques aux dépositions naturelles de fer mises en évidence lors de mes expériences précédentes. Pour ce faire, j’ai effectué des enrichissements de poussière dans de l’eau de mer au pH actuel de 8.0 et dans l’eau de mer acidifiée à un pH de 7.8. Mes résultats ont montré une diminution du taux de croissance du phytoplancton dans le milieu acidifié mais pas de changement notable dans la structure de la communauté. Les ajouts de poussières et de cendres, de même que les variations de pH, n’ont pas eu d’effet significatif sur la production de DMS et de son précurseur le diméthylsulfoniopropionate (DMSP), probablement en raison de la courte durée (4 jours) des expériences. L’ensemble des résultats de cette thèse montre que le fer contenu dans diverses sources atmosphériques naturelles est biodisponible pour le phytoplancton du Pacifique Nord-Est et que des taux de déposition réalistes peuvent stimuler la croissance de manière notable dans les premiers jours suivant une tempête désertique ou une éruption volcanique. Finalement, les résultats de mes expériences à stresseurs multiples Fer/acidification suggèrent une certaine résistance des communautés phytoplanctoniques à la diminution du pH prédite d’ici la fin du siècle pour les eaux de surface des océans.

Identification des gènes modifiant l’âge d’apparition du glaucome primaire à angle-ouvert dans une famille canadienne-française fondatrice.

Le glaucome est un groupe hétérogène de maladies qui sont caractérisées par l’apoptose des cellules ganglionnaires de la rétine et la dégénérescence progressive du nerf optique. Il s’agit de la première cause de cécité irréversible, qui touche environ 60 millions de personnes dans le monde. Sa forme la plus commune est le glaucome à angle ouvert (GAO), un trouble polygénique causé principalement par une prédisposition génétique, en interaction avec d’autres facteurs de risque tels que l’âge et la pression intraoculaire élevée (PIO). Le GAO est une maladie génétique complexe, bien que certaines formes sévères sont autosomiques dominantes. Dix-sept loci ont été liés à la maladie et acceptés par la « Human Genome Organisation » (HUGO) et cinq gènes ont été identifiés à ces loci (MYOC, OPTN, WDR36, NTF4, ASB10). Récemment, des études d’association sur l’ensemble du génome ont identifié plus de 20 facteurs de risque fréquents, avec des effets relativement faibles. Depuis plus de 50 ans, notre équipe étudie 749 membres de la grande famille canadienne-française CA où la mutation MYOCK423E cause une forme autosomale dominante de GAO dont l’âge de début est fortement variable. Premièrement, il a été montré que cette variabilité de l’âge de début de l’hypertension intraoculaire possède une importante composante génétique causée par au moins un gène modificateur. Ce modificateur interagit avec la mutation primaire et altère la sévérité du glaucome chez les porteurs de MYOCK423E. Un gène modificateur candidat WDR36 a été génotypé dans 2 grandes familles CA et BV. Les porteurs de variations non-synonymes de WDR36 ainsi que de MYOCK423E de la famille CA ont montré une tendance à développer la maladie plus jeune. Un outil de forage de données a été développé pour représenter des informations connues relatives à la maladie et faciliter la priorisation des gènes candidats. Cet outil a été appliqué avec succès à la dépression bipolaire et au glaucome. La suite du projet consiste à finaliser un balayage de génome sur la famille CA et à séquencer les loci afin d’identifier les variations modificatrices du glaucome. Éventuellement, ces variations permettront d’identifier les individus dont le glaucome risque d’être plus agressif.

Fonctions et régulations des protéines Crumbs dans la morphogenèse des tissus épithéliaux

Les tissus épithéliaux recouvrent les surfaces et les cavités du corps et fonctionnent comme des barrières sélectives capables d’échanges entre les différents compartiments de l’organisme. La fonctionnalité de ces tissus repose notamment sur la mise en place et le maintien d’une asymétrie structurale des cellules épithéliales, aussi appelée « polarité épithéliale ». La modulation des mécanismes orchestrant l’asymétrie membranaire est centrale dans la formation et le maintien de l’architecture des tissus épithéliaux. Ainsi, des défauts de polarité épithéliale provoquent des anomalies morphologiques et fonctionnelles des tissus épithéliaux, qui peuvent contribuer au cancer chez l’Homme. C’est pourquoi, la compréhension des processus liés à la polarité épithéliale constitue des objectifs cruciaux dans la biologie des épithéliums et dans la santé humaine, pour assurer le développement de nouvelles thérapies liées au rétablissement des fonctions soutenues par une asymétrie membranaire. Les mécanismes de polarité épithéliale et leurs fonctions signalétiques dans la morphogenèse des tissus épithéliaux jouent un rôle central dans ma thèse et font l’objet de mon introduction. Mon projet de doctorat a consisté à caractériser la fonction et la régulation de Crumbs, un acteur clé dans la mise en place du domaine apical, dans le contrôle de la morphologie cellulaire et dans la morphogenèse des tissus épithéliaux. C’est pourquoi, l’étude de la régulation de la fonction de Crb au sein de la cellule épithéliale revêt un rôle capital dans la compréhension de la biologie des épithéliums. Dans ce cadre, nous avons d’abord permis d’approfondir les modalités d’une éventuelle fonction du domaine extracellulaire de CRB3A. De plus, nous montrons que la GTPase Rac1 permet de contrôler Crumbs dans un contexte tridimensionnel. Ainsi, nous proposons un modèle fonctionnel de Crumbs, soutenu par des approches in vitro et in vivo, dans le contrôle de la morphologie cellulaire et la morphogenèse des tissus tridimensionnels.

Valves cardiaques par génie tissulaire - Simplification des essais et concept tubulaire

Les substituts valvulaires disponibles actuellement comportent encore plusieurs lacunes. La disponibilité restreinte des allogreffes, les risques de coagulation associés aux valves mécaniques et la durabilité limitée des bioprothèses en tissu animal sont toutes des problématiques que le génie tissulaire a le potentiel de surmonter. Avec la méthode d’auto-assemblage, le seul support des cellules consiste en leur propre matrice extracellulaire, permettant la fabrication d’un tissu entièrement libre de matériau exogène. Ce projet a été précédé par ceux des doctorantes Catherine Tremblay et Véronique Laterreur, ayant respectivement développé une méthode de fabrication de valves moulées par auto-assemblage et une nouvelle version de bioréacteur. Au cours de cette maîtrise, le nouveau bioréacteur a été adapté à une utilisation stérile avec des tissus vivants et la méthode de fabrication de valves moulées a été modifiée puis éprouvée avec la production de 4 prototypes. Ces derniers n’ont pas permis d’obtenir des performances satisfaisantes en bioréacteur, motivant la conception d’une nouvelle méthode. Plutôt que de tenter de répliquer la forme native des valves cardiaques, des études récentes ont suggéré une géométrie tubulaire. Cela permettrait une fabrication simplifiée, une implantation rapide, et un encombrement minimal en vue d’opérations percutanées. Cette approche minimaliste s’accorde bien avec la méthode d’auto-assemblage, qui a déjà été utilisée pour la production de vaisseaux de petits diamètres. Un total de 11 tubes ont été produits par l’enroulement de feuillets fibroblastiques auto-assemblés, puis ont été transférés sur des mandrins de diamètre inférieur, leur permettant de se contracter librement. La caractérisation de deux tubes contrôles a démontré que cette phase de précontraction était bénéfique pour les propriétés du tissu en plus de prévenir la contraction en bioréacteur. Les prototypes finaux pouvaient supporter un écoulement physiologique pulmonaire. Cette nouvelle méthode montre que le procédé d’auto-assemblage a le potentiel d’être utilisé pour fabriquer des valves cardiaques tubulaires.

Mise en évidence de dysfonctions liées au développement de l'endométriose péritonérale Contributions angio-inflammatoires des cytokines et prostaglandines

L’endométriose est une maladie gynécologique, touchant les femmes en âge de procréer. Cette pathologie est caractérisée par la présence de tissu endométrial ectopique, c’est-à-dire en dehors de la cavité utérine. Des dysfonctions du système immunitaire sont de plus en plus souvent suspectées comme étant un des éléments responsables de la pathogenèse de cette maladie. L’objectif général de ce projet a donc été d’étudier les mécanismes cellulaires de molécules pro-inflammatoires aux propriétés variées et à l’expression anormalement élevée dans cette pathologie, que sont MIF et les prostaglandines PGE2 et PGF2α, dans les anomalies inflammatoires et invasives en cause dans cette pathologie. La première partie de nos travaux a porté sur l’étude d’un modèle murin de l’endométriose déficient du gène MIF. Le nombre et le volume des lésions collectées à partir des souris déficientes pour le gène MIF sont significativement inférieurs à ceux mesurés dans des souris sauvages utilisées comme contrôle. L’analyse par PCR des cellules isolées des lésions de souris déficientes du gène MIF a révélé une expression réprimée des protéines d’adhésion, d’inflammation et d’angiogenèse. Ces données démontrent pour la première fois que le MIF agit directement sur la croissance et la progression de lésions d’endométriose in vivo. Une partie de nos travaux a porté sur les molécules nécessaires au métabolisme de PGE2 et PGF2α dans l’endomètre eutopique des femmes normales et l’endomètre eutopique et ectopique des femmes atteintes d’endométriose. Selon nos données, l’expression de certains de ces facteurs est perturbée durant cette maladie, ce qui peut avoir des effets délétères sur la physiologie de la procréation. La stimulation des cellules ectopiques par PGF2α entraîne une libération accrue de VEGF et CXCL-8, ceci via l’induction de COX-2 et des deux variants d’épissage du récepteur FP. De plus, la PKC joue un rôle dans ce phénomène, dépendamment et indépendamment de la PLC. Par son effet inducteur sur la libération de VEGF et CXCL-8, PGF2α pourrait favoriser l’aspect inflammatoire et le développement ectopique des lésions d’endométriose, notamment par des phénomènes d’angiogenèse et de prolifération cellulaire accrus. L’effet de PGF2α sur la libération de VEGF et CXCL-8 par les cellules endométriales ectopiques pourrait également expliquer les quantités élevées de ces cytokines dans le liquide péritonéal des femmes atteintes d’endométriose, un phénomène suspecté dans l’infertilité et les douleurs associées à cette maladie. Nos derniers résultats obtenus à partir du liquide péritonéal montrent un profil cytokinique en faveur de l’angiogenèse et la prolifération des lésions d’endométriose, avec une forte augmentation des facteurs suivants : EGF, FGF-2, IL-1α, MIP-1β, TGFα, PDGF-AA, PDGF-BB, MCP-3, sCD40L, Gro Pan, IL-17α, MDC et Rantes, confortant nos observations préalables redéfinissant la maladie comme étant d’origine angio-inflammatoire. L’endométriose et ses symptômes sont des phénomènes complexes ayant probablement plus qu’une seule origine. Parmi les nombreux facteurs à l’expression altérée dans l’endométriose, notre étude montre que MIF, PGE2 et PGF2α, ainsi qu’une pléthore de facteurs pro-angiogéniques pourraient être de ceux jouant un rôle dans l’infertilité et les douleurs reliées à cette maladie.

Caractérisation des inhibiteurs de DCIR, une lectine de type C participant à la transmission du VIH-1

Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 provoque une infection définitive de l’organisme. Il entraine une déroute du système immunitaire depuis la primo-infection occasionnant ainsi, une déplétion massive des lymphocytes T CD4 (LTCD4). Le DCIR (Dendritic Cell Immuno Receptor) qui constitue le socle de notre travail, est une lectine de type C. Il est exprimé sur les cellules myéloïdes comme les cellules dendritiques mais aussi sur les cellules B, les LTCD4 infectés par le VIH-1 et apoptotiques ainsi que sur les LTCD4 polarisés en Th17. Il constitue un facteur d’attachement et d’internalisation du virus dans la cellule dendritique. Il permet son transfert aux LTCD4 dans les organes lymphoïdes secondaires, jouant ainsi un rôle dans la pathogenèse associée au VIH-1. En plus, le DCIR assure la régulation négative de la réponse cellulaire, favorisant ainsi la propagation et la réplication du virus au détriment de la réponse immunitaire contre le VIH-1. Le rôle que joue le DCIR est dépendant du sentier de signalisation induit à la suite de la phosphorylation des résidus tyrosine de son motif ITIM. Le blocage de DCIR par des inhibiteurs spécifiques pourrait empêcher cette phosphorylation et réduire l’attachement, l’internalisation et le transfert du virus. Nous avons montré que la stimulation des cellules dendritiques et des LTCD4 polarisés en Th17 avec un anticorps anti-DCIR générait un patron de phosphorylation des résidus tyrosine des protéines. De plus, les inhibiteurs de la portion extracellulaire du DCIR inhibent cette activation. Afin de développer une mesure plus directe de l’interaction de DCIR avec ces inhibiteurs, nous avons purifié le DCIR à partir des cellules Raji-CD4-DCIR. En conclusion, ce projet de maitrise montre que l’activation directe de DCIR peut être renversée par des inhibiteurs montrant ainsi leurs spécificités. De plus, le profil d’activation de DCIR est spécifique pour chaque type cellulaire. A long terme, l’inactivation de DCIR par des inhibiteurs efficaces pourrait être une stratégie thérapeutique capable d’inhiber l’infection et de préserver une réponse immunitaire efficace.

Métabolisme des glucocorticoïdes dans le poumon murin en développement : la voie surrénalienne

Lorsqu’une femme est à risque d’accoucher prématurément, des glucocorticoïdes lui seront administrés afin d’accélérer la maturation pulmonaire du bébé. Après la naissance, différents protocoles peuvent être mis en place pour aider l’enfant à respirer dont l’administration du surfactant et la ventilation. Les glucocorticoïdes ont un effet positif sur la maturation pulmonaire. Par contre, ils nuisent au processus de la septation après la naissance. Les glucocorticoïdes retrouvés dans le poumon en développement peuvent provenir de deux sources, soit de la voie classique de la synthèse des glucocorticoïdes par les surrénales, soit des gènes exprimés dans le poumon. Les sites d’expression des gènes codant pour les enzymes de la synthèse des glucocorticoïdes dans le poumon sont inconnus ainsi que le gène de la 20α-hydroxystéroïde déshydrogénase (20α-HSD). Cette dernière inactive le substrat et le produit de la 21-hydroxylase. Des poumons de fœtus de souris au jour de gestation 15,5, 17,5 et 19,5 ainsi que de souriceaux âgés de 0, 5 et 15 jours ont été utilisés pour des hybridations in situ. Cette étude a montré qu’avant la naissance, l’ARNm de la 21-hydroxylase est situé au niveau des cellules épithéliales distales alors que l’ARNm de la 20α-HSD se retrouve plutôt au niveau des capillaires. Les gènes de la 21-hydroxylase et de la 20α-HSD sont exprimés dans les cellules épithéliales proximales ainsi que dans les cellules endothéliales de veines dans la période entourant la naissance. À la fin du stade sacculaire et pendant le stade alvéolaire, le gène de la 21-hydroxylase est exprimé seulement dans les septa et les parois minces tout comme le gène de la 20α-HSD sauf dans le stade alvéolaire où il n’y avait pas de signal significatif. Ainsi, ces résultats suggèrent que la 20α-HSD pourrait participer au contrôle du niveau d’activité de la 21-hydroxylase en modulant la disponibilité de son substrat.